التقانات الحيوية, المؤشرات الجزيئية, المادة الوراثية,البوليميراز, البرايمر, الرحلان ,الأغاروز, تتالي الأسس الأزوتية, المورثات,U.V, الطفرات, استنساخ الدنا PCR,SSR, ISSR,RAPD,RFLP,AFLP

التقانات الحيوية:

التقنيات التي تستخدم الكائنات الحية أو مستخرجاتها في تطوير أو تحسين إنتاج الأدوية والأغذية والمحاصيل الزراعية ومستلزمات الرعاية الصحية ومعالجة كثير من المشاكل البيئية والزراعية.

الأهمية الإقتصادية للتقنيات الحيوية:

-         تطوير قطاع الصناعات الدوائية.

-         تطوير قطاع الصناعات الغذائية.

-         تطوير قطاع البيئة.

-         تطوير القطاع الصحي و الطبى .

-         تطوير القطاع الزراعي.

المادة الوراثية:

يمكن تعريفها على أنها التركيبة الكاملة للتعليمات الخاصة بتكوين الكائن الحي، وتحتوي على البصمات التي تحدد كل مكونات وأنشطة الخلية طوال حياة الكائن الحي، وهذه العوامل الوراثية موجودة على أشرطة من الحمض (DNA) حلزونية الشكل بالإضافة إلى جزئيات البروتين، وهما معا يكونان وحدات تسمى الكروموسومات، وعلى هذه الكروموسومات توجد المورثات أو الجينات (Genes) وهي التي تحدد كل صفات الكائن الحي.

المعلمات الجزيئية

1- المؤشرات المظهرية Morphological Markers :

•تعد المؤشرات المظهرية هي الطريقة الأسهل والأقل تعقيدا للتمييز بين الإفراد وتعد أول وأقدم طريقة لدراسة التنوع الوراثي ولا يمكن الاستغناء عنها إذ تعتمد على إيجاد التباينات بين الأفراد بالاستناد إلى الصفات المظهرية مثل اللون أوطبيعة النمو او كمية الانتاج، ولكن تأثر هذا النوع من المؤشرات بالظروف البيئية بشكل كبير حيث يختلف المظهر الخارجي لنفس النوع باختلاف ظروف النمو الخارجية، كما إن أعداد تلك المؤشرات قليلة أي إنها تمثل عدداً قليلاً من المواقع (loci) في المجين Genome فضلاً عن أن بعض الصفات المظهرية يتحكم بها اكثر من جين مما يجعل من الضرورة استخدام مؤشرات أكثر ثباتاً اتجاه العوامل الخارجية.

2- المؤشرات الإنزيمية     Isozyme Markers 

•يمكن تعريف الـ Isozyme بأنه الشكل الآخر لإنزيم معين يشبه ذلك الإنزيم بالوظيفة لكنه يختلف عنه في تسلسل الأحماض الامينية فيه وبذلك يمكن فصلها عن بعض باستخدام الهجرة الكهربائية، ويتميز أفراد النوع الواحد بثبات عدد تلك الإنزيمات لذلك فباستخدام التحليلات أعلاه يمكن تمييزها عن بعض وأول من طور هذه الطريقة هو Bartels (1971) وتصنف ضمن المؤشرات الجزيئية Molecular Markers لان البروتين ناتج عن تعبير الجين ويتم ترحيل هذه الانزيمات المتناظرة على هلام الـ Polyacrylamide او النشا ويعرف خط توزيع الحزم للعينة المرحلة بأنها بصمة الإنزيمات المتناظرة لذلك الفرد او الصنف Isozyme fingerprint ويتم إظهار هذه الحزم بتصنيفها ومقارنة أنماط توزيع الحزم للفرد وإيجاد التباينات المطلوبة.

• إلا أنهذه المؤشرات فان لها العديد من المساوئ منها أن التعبير الجيني غالبا ما يتأثر بالظروف البيئية ونوع النسيج المستخدم لهذه التحليلات ومرحلته العمرية فضلاً عن أن عدد المتناظرات الإنزيمية يكون قليلاً او محدوداً.

:صفات المعلمات الجزيئية المناسبة

التعددية الشكلية.

السيادة المشتركة.

تظهر الاختلافات الوراثية بشكل دقيق.

موزعة ومكررة بانتظام على الجينوم.

سهلة ورخيصة.

ذات تكرارية عالية.

تستخدم المعلمات الجزيئية للعديد من التطبيقات منها:

Genetic diagnostics               .الكشف الجيني

Study of genome                 .دراسة الجينوم 

Paternity testing and the investigation of crimes       . اختبارات الابوة  والتقصي في الجرائم

Measure the genomic response to selection in livestock. 

قياس استجابة المادة الوراثية للانتخاب

مؤشرات الدنا      DNA Markers :

تعرف مؤشرات الدنا بأنها تتابعات من الدنا يمكن الاستدلال بها على موقع معين على الكروموسوم او الجين، وتستخدم لدراسة العلاقات الوراثية بين الأفراد وإيجاد البصمة الوراثية لكونها تعكس الاختلافات في المعلومات الوراثية المخزونة فيهم وهذه الاختلافات تكون ناتجة أما من الحذف Deletion، او الإدخال Insertion، او اعادة الترتيب Rearrangement  للنيوكليوتيدات في مجين الأفراد المدروسة لأي سبب كان كالطفرات الوراثية لذلك اعتمدت في دراسات التصنيف الجزيئي taxonomy Molecular والدراسات التطورية  Evolutionary studies   وفي بناء الخرائط الوراثية  Genetic Mapping ، كما أصبحت من الأدوات المهمة لدراسة التنوع الوراثي  Genetic Diversity، اذ تعد الاختيار الذي لا بديل له في تطوير الخطط الملائمة لحفظ الأنواع، وبما ان هذه المؤشرات تعكس الاختلافات مباشرة على مستوى القواعد المكونة للدنا ونظرا لان مجين الكائنات الحية الراقية يحتوي على الملايين من هذه القواعد لذلك فان اعداد هذه المؤشرات كبيرة جداً .وبالتالي فان لها القدرة على الكشف عن مئات المواقع Loci  ولعدة أليلات للموقع الواحد.

ميزاتها:

 تمتاز هذه المؤشرات مقارنة بالمؤشرات السابقة بمزايا عديدة ومن ابرز هذه المميزات إنها تظهر التغاير الذي يحدث على مستوى الدنا مباشرة و كما هو معروف فان الدنا هو المادة الوراثية المستقرة التي لا تتأثر بالبيئة لذا امتازت هذه المؤشرات بالاستقرارية Stability  بعكس المؤشرات الوراثية المعتمدة على الصفات المظهرية التي تتأثر بشكل كبير بالظروف البيئية، وكذلك تمتاز هذه المؤشرات بكونها تعتمد على مادة الدنا الموجودة في جميع خلايا الكائن وبشكل  متساوٍ لذا فان تحليل أي جزء من ذلك الكائن وفي أي مرحلة عمرية سوف يعكس بالنتيجة حالة الكائن الوراثية وعلى نحو دقيق مما يمنح هذا النوع من المؤشرات الشمولية ويجعلها تتفوق على المؤشرات المعتمدة على تحليل المحتوى البروتيني لذلك الكائن او حتى على ما تمثله هذه البروتينات من متناظرات إنزيمية.

•ومن المميزات الاخرى لمؤشرات الدنا هي قدرتها على كشف أعداد كبيرة من التباينات Numerous Polymorphic   مما جعلها قادرة على إيجاد أي اختلاف مهما كان طفيفاً وبين أقرب الأفراد فضلاً عن قدرتها على تتبع التغيرات الوراثية عبر الأجيال كونها تستند إلى قوانين مندل في التوارث، كما تبرز أهمية مؤشرات الدنا من خلال تطبيقاتها الواسعة وفي شتى المجالات ومن أهمها في ايجاد البصمة الوراثية (DNA Fingerprinting) والتمييز والتشخيص المبكر لأصناف السلالات وتحديد القرابة بينها والتمييز المبكر للجنس في النباتات ومساعدة مربي النبات في تسهيل مهمة التضريب والتهجين او تطوير أصناف جديدة من خلال تحديد مستوى التغايرات وكذلك فحص نقاوة البذور وحفظ حقوق مربي النبات لتمييز الأصناف المقاومة للأمراض والكشف المبكر عن الإصابات المرضية .

• ومن الجوانب العلمية والتطبيقية في مجال إيجاد البصمة الوراثية هو تطوير العديد من مؤشرات الدنا لاستخدامها في التحقق والتأكد من الثبات الوراثي للنباتات الناتجة من الزراعة النسيجية وخاصة النباتات المعمرة كالنخيل وأشجار الفاكهة وغيرها وإصدار شهادة التطابق الوراثي مع الأصل لضمان جودة المنتج ومنع الغش التجاري لحماية حقوق كل من المستثمر والمستهلك.

أنواع مؤشرات الدنا : 

•نتيجة لميزات هذه المؤشرات و مجالات تطبيقاتها الواسعة وبسبب التطور السريع في مجالات علم الأحياء الجزيئي فقد تم استحداث وإيجاد العديد من أنواع مؤشرات ألدنا فقد تم حديثاً تصنيف هذه المؤشرات الى نوعين أساسيين اعتماداً على نوع التقانة المستخدمة في إيجادها والكشف عنها وهي :

أولاً :  مؤشرات الدنا المعتمدة على التهجين الجزيئي :

ظهرت أولى مؤشرات الدنا المعتمدة على التهجين الجزيئي بعد اكتشاف إنزيمات التقييد Restriction enzymes  عام 1968 و وصمة سوذرن  Southren عام 1975 ببناء أول تقانه أطلق عليها تباين أطوال قطع التقييد (RFLP) وتعرف على أنها توارث الاختلافات  في مواقع القطع الإنزيمي الذي يتسبب في ظهور أطوال مختلفة من قطع الدنا على الأغاروز.

ان منهجية الـ RFLP  تعتمد على الاختلافات في طرز التقطيع الذي يحدث بسبب طفرة نيوكليوتيدية واحدة عن موقع القطع او بوساطة القطع المضافة او المحذوفة او المستبدلة عن تلك المواقع مما يؤدي الى تباين اطوال القطع الناتجة وبوجود المجس probe  المعلم اما بمواد مشعة او مواد كيميائية يمكن التعرف على القطع المتباينة بارتباط المجس مع التسلل المكمل ولقد استخدمت هذه المؤشرات في بناء الخارطة الوراثية للإنسان وفي مجال تحسين النبات.

     ثانياً : مؤشرات الدنا المعتمدة على تفاعل PCR

•وصف التفاعل التضاعفي لسلسلة الدنا (PCR) لأول مرة من قبل الباحث Kary Mullis في عام 1985على أساس أن عمل هذه التقانة هو مضاعفة قطعة معينة من الدنا المنتجة من المجين الكلي أنزيمياً وخارج الجسم الحي in vitro  بوجود البادئات Primers والتي تربط بالتتابع المكمل لها على شريط الدنا القالب Template DNA

•وتعد هذه العملية محاكاة لما يحدث في الطبيعة في جميع الكائنات الحية والتي تتضاعف مادتها الوراثية أثناء الانقسام فالتفاعل بسيط ومحتوياته موجودة منذ قدم الحياة قبل ان ينفذها Mullis خارج الجسم الحي وقد توصل الى ذلك بالـصدفة عنـدما كان يبحث عن طريقة لتشخيص الطفرة الوراثية التي تسبب مرض فقر الدم المنجلي (Sickle cell anemia) فتوصل الى طريقة لتضاعف قطعة من الدنا موجودة  بكميات قليلة جداً لإجراء الدراسات اللازمة عليها.

 أهمية المؤشرات التي تعتمد على PCR:

•تكمن أهمية تفاعل الـPCR  بتفردها بعدة مميزات كالدقة والخصوصية والحساسية العالية في الكشف عن قطعة دنا معينة ضمن الآلاف من القطع لذلك أصبحت لا يمكن الاستغناء عنها في دراسات الوراثة الجزيئية ، فضلاً عن أنها طريقة عمل سهلة نسبياً وسريعة وخاصة عند الاحتياج لتحليل عينات عديدة. لذلك فقد أصبح لهذا التفاعل تطبيقات واسعة منها دراسة التنوع الوراثي وإيجاد البصمة الوراثية وكذلك في مجال التربية والتحسين للحيوانات والنباتات الاقتصادية إذ استخدمت هذه التقانة لتسهيل نتائج التضريب والتهجين عند محاولة استنباط أصناف جديدة  وكذلك استخدمت في مجال تشخيص الأمراض المختلفة كالأمراض الوراثية والوبائية وذلك بالاستناد إلى المبادئ الأساسية لهذه التفاعلات .

•وتجري حالياً باستخدام تقانة الـ PCR تشخيص الإصابات الفيروسية للإنسان ، كفيروس التهاب الكبد والأنفلونزا والحصبة وفيروسات نقص المناعة المكتسبة الإيدز (HIV)، وفيروسات أنفلونزا الطيور مثل الفايروس (H5N1)، والأمراض السرطانية، كذلك أصبحت من التقانات التي يعتمد عليها في تحديد الأبوة الشرعية ومجال التحقيق الجنائي والطب العدلي Forensic medicine.

•مما تقدم تظهر الأهمية الكبيرة لهذه التقانة واستخداماتها الواسعة مما دعا الباحثين الى العمل الدوؤب والمستمر لإيجاد أنواع جديدة من مؤشرات الدنا المعتمدة على هذه التقانة فضلاً عن العدد الكبير الذي تحقق منها.

•

أولاً :  المؤشرات التي تستهدف مواقع متعددة من المجين :

أ- المؤشرات التي تستخدم بادئات عشوائية تماماً كمؤشرات نسق النواتج المتضاعفة المتعددة العشوائية (MAAP Multiple Arbitrary Amplicon Profiling) وهذه تشمل بدورها مؤشرات التفاعل العشوائي متعددة الاشكال لسلسلة الدنا او الـ RAPD – RCR   والتفاعل العشوائي لتسلسل الدنا او الـ AP – RCR، Arbitrary Primed PCR   وبصمة الدنا المتضاعفة  DAF ،DNA Amplification Fingerprinting  

ب - المؤشرات التي تستخدم فيها بادئات شبه عشوائية Semiarbitrary Primers كمؤشرات تباين أطوال قطع الدنا المتضاعفة أو الـ AFLP.

جـ - المؤشرات التي تستخدم فيها بادئات متخصصة كمواقع محددة متوزعة داخل المجين كالـ Alu – PCR ومؤشرات التتابعات القصيرة المتكررة SSR.

ثانياً : المؤشرات التي تستهدف موقع محدد معروف التسلسل :

–ان تطبيق هذا النوع يحتاج الى معرفة تسلسل موقع الدنا الهدف الذي ليس بالضرورة ان يكون في النواة بل قد يكون في المايتوكوندريا او الكلوروبلاست في الخلايا النباتية والحيوانية ومن الامثله على هذا النوع من المؤشرات:

– Alpha – Amylase Gene Analysis

–Ribosomal Gene Analysis

•يعد الـ PCR التقنية الأكثر رواجاً في مختبرات الوراثة الجزيئية في جميع أنحاء العالم والأساس الذي تعتمد عليه الكثير من الدراسات على مستوى الدنا  وبهذا استحق عليها Mullis جائزة نوبل عام 1993 اذ جعلت امكانية استخدام قطرة دم او شعرة او حتى خلية واحدة لإجراء عمليات الـ PCR عليها.

•تتطلب تقانة الـ PCR إنزيم بلمرة الدنا (Taq DNA Polymerase ) ، والبادئات (Primers) والنيوكليوزيدات منقوصة الاوكسجين الثلاثية الفسفور (deoxynucleosid triphosphates) والمحلول الدارئ (PCR buffer) المحتوي على ايونات المغنيسيوم (Mg⁺⁺) وقالب الدنا (DNA Template)، فضلاً عن جهاز المبلمر الحراري (Thermocycler).

أ - أنزيم البلمرة     DNA Polymerase  : 

•يعد إنزيم بلمرة الدنا واحداً من المكونات الأساسية و الرئيسة في تفاعلات الـPCR، اذ تعتمد هذه التفاعلات على قابلية هذا الإنزيم على البناء وبالتالي مضاعفة تتابعات محدده من الدنا القالب المكملة لتتابعات البادئ ، لذا فان الاهتمام في تطوير نوعية وكفاءة هذا الإنزيم حظي باهتمام الكثير من الباحثين و المختصين بهذا المجال ، وقد استهل العمل بهذه التقانة مع إنزيم البلمرة klenow fragment المستخلص من  بكتريا القولون E.coli  وهو من نوع DNA Polymerase I  إلا أن هذا الإنزيم يفقد القدرة على البناء عند تعرضه الى الحرارة العالية المطلوبة لمسخ خيوط الدنا القالب مما يجعل عمله يتوقف إلا بإضافة كميات أخرى منه في كل دورة مما جعل الباحثين يتجهون إلى استنباط نوع جديد هو Taq Polymerase  الثابت حراريا والمعزول من البكتريا المحبة للحرارة  Thermophallic Eubacterium  وتدعى Thermus aqueticus إذ أن له القدرة على الاستمرار بنشاطه وبدرجة 95 مْ وبناء قطع اطول من الانزيم السابق ، إذ تتراوح افضل درجات فعاليته في البناء بين    (70 – 80مْ) وله نشاط خاص في البناء يتراوح بـ (35 – 100) نيوكليوتيدة في الثانية لكل جزيئه إنزيم إذ يضيف القواعد عند النهاية  OH  ^-3 

•تتألف جزيئة الإنزيم Taq DNA Polymerase من سلسلة مفردة من الببتيد المتعدد وذي وزن جزئي يقارب 95 كيلودالتون ، ولذا عرفت الوحدة الانزيمية one unit على إنها كمية الإنزيم اللازمة لسحب 10 نانومول من التركيب الكلي للنيوكليوتيدات dNTPs في خليط التفاعل وتحويلها إلى حامض الدنا القالب القابل للترسيب خلال 30 ثانية وبدرجة 75مْ وتحت ظروف التفاعل المثلى.

ب- البادئ    The Primer  :

•يعرف البادئ بكونه قطعة قصيرة من الدنا او الرنا (RNA) ترتبط بقالب شريط  الدنا المفرد الشريط عند النهاية ^-3 المحتوية على مجموعة الهيدروكسيل OHالضرورية لبدأ عمل إنزيم بلمرة الدنا.

• وهناك عدة أنوع من البادئات تختلف في طبيعتها باختلاف نوع المؤشرات فقد تكون ذات تتابعات عامة  Universal ويمكن استخدامها مع مجين كل الكائنات، وقد تكون تلك البادئات مصممة بشكل خاص ليتعرف على موقع متخصص متوزع بشكل عشوائي داخل المجين ، وقد يصمم البادئ بوجود تسلسل معين في تركيبه كتلك المستعملة في تحليلات الـ AFLP  والـ DAF  كما سياتي شرحه لاحقاً.  

جـ - المحلول المنظم  :PCR buffer

•المحلول المنظم هو المحلول الذي يحافظ على قيمة رقمه الهيدروجيني من التغيرات عند إضافة حامض أو قاعدة إليه أو عند تخفيف المحلول، ويقوم هذا المحلول بعملية تنظيم عمل إنزيم البلمرة والمحافظة على نشاطه لذا أصبح هناك العديد منها وفقاً لنوع الإنزيم المستخدم . وتختلف هذه المحاليل المنظمة من حيث تركيز مكوناتها والرقم الهيدروجيني لها ، إلا أن القياسية منها تحتوي على المكونات الرئيسة مثل كلوريد المغنيسيوم ₂MgCl بتركيز 50 مللي مولر وكلوريد البوتاسيوم KCL وبتركيز 1.5 مللي مولر والترس الحامضي Tri-HCl بتركيز 100 مللي مولر ذي رقم هيدروجيني قدره 8.3 فضلاً عن 0.1% حجم/وزن من الجيلاتين ليصبح المحلول بقوة 10X  ويتم تخفيفه اثناء تحضير التفاعل ليصبح X 1.

د- النيوكليوسيدات ثلاثية الفوسفات  :( dNTPs )

وهي عبارة عن القواعد النتروجينية الاربع مع سكر منقوص الاوكسجين وثلاث مجاميع من الفوسفات والتي تشكل مادة بناء شريط الدنا و الذي يقوم انزيم بلمرة الدنا باضافته الى النهاية OH  بدأً من نقطة ارتباط البادئ بالقالب وبطول يختلف حسب نوع المؤشرات المستخدمة وهي :

 (Deoxy Adenosine  Triphosphate   (dATP     

     ( Deoxy   Thymosine    Triphosphate   (dTTP 

(Deoxy    Guanosine    Triphosphate    (dGTP

(Deoxy    Cytosine     Triphosphate     ( dCTP    

 وتضاف هذه المكونات الأربعة بتراكيز متساوية ومناسبة لأجراء التفاعل ويعتمد ذلك التركيز على تركيز  Mg⁺⁺ وذلك لأن زيادة تركيز الـ dNTPs  يؤدي الى قله الـ Mg⁺⁺  الجاهز لفعالية إنزيم بلمرة الدنا ،وكذلك يتاثر تركيز الـ dNTPs  بتركيز البادئات المستعملة وطول القطع المتضاعفة وعدد دورات الـ PCR   ويمكن الوصول الى التركيز المناسب تجريبياً .

هـ - قالب الدنا   DNA Template  :

•إن التطور في تقنيات لـ PCR وفرت طريقة سريعة وكفوءة للكشف عن وجود او غياب تتابع معين من قواعد الدنا في نموذج ما مما جعل بالإمكان تحليل مئات النماذج مرة واحدة وخاصة عند توفير قالب الدنا الملائم الذي يمكن الحصول عليه من مصادر عديدة كالمكتبات المجينية Genomic libraries كما ويمكن الحصول على دنا الحيوانات والنباتات المختلفة وبشكل تجاري ومن مختلف الأنسجة والخلايا.

•توجد عدة طرق لاستخلاص وتحضير الدنا وهناك بعض المشاكل تبرز عند استخلاص الدنا وهي تحلل الدنا DNA degradation لوجود السكريات المتعددة والمواد الفينولية وغيرها من المركبات والتي تعمل على تحطيم الدنا أوتثبيط عمل الإنزيمات القاطعة وإنزيمات بلمرة الدنا في المراحل اللاحقة كما تكون مستحضرات الدنا في هذه الحالة بلون بني بسبب اكسدة المواد الفينولية الى مركبات الـ Quinone إذ تعد هذه المواد عوامل مؤكسدة قوية تعمل على تحطيم الدنا والبروتين لذلك لا يمكن الحصول في هذه الحالة على الدنا بوزن جزيئي لذلك يجب اختيار طريقة استخلاص مناسبة لتجنب المشاكل أعلاه واختصار خطوات العمل لتتوافق مع تقنيات الـ PCR السريعة والتي تتطلب خطوات اقل لتجنب التلوث.

و- جهاز المبلمر الحراري         Thermocycler  :

• إن اكتشاف جهاز المبلمر الحراري ادى الى تجاوز الكثير من المحددات المهمة لتقنية الـ PCR عند بداية اكتشافها إذ كانت تستعمل طريقة النقل اليدوي للنماذج بين الحمامات المائية للحصول على الدرجات الحرارية المطلوبة لكل دورة من دورات الـ PCR ، ويعد هذا الجهاز من اهم متطلبات تفاعل الـ PCR ولقد تم تطوير هذه الأجهزة من ناحية استيعابها لعدد اكبر من العينات تصل الى حوالي 96 حفرة بدلاً من الأنابيب وهذا يسرع في عملية تحضير النماذج وكذلك الكشف عن النواتج وعلى العموم يؤثر الجهاز المستعمل في نتائج التفاعل والمدة المستغرقة في كل دورة وعدد الدورات والوقت المستغرق بين دورة واخرى (Ramp time) والذي يفضل ان يكون اقصر ما يمكن وذلك ليمنع استطالة البادئات المرتبطة بالمواقع الخطأ.

مراحل التفاعل التضاعفي لسلسلة الدنا   PCR Stages    :

لقد تم تحديد تفاعل الـ (PCR ) بثلاث مراحل او خطوات أساسية تتكرر في كل دورة من دورات التضاعف ولمدة زمنية محددة، وهذه المراحل هي :

qالمسخ Denaturation  :

تعد هذه المرحلة الأولى و الأساسية في تحضير دنا القالب مزدوج السلسلة Double strand للعمليات اللاحقة ومن المعروف إن تلك العملية تحدث في الخلية  In vivo  أثناء الطور البيني من الانقسام الخلوي وبواسطة إنزيمي الـ DNA   Helicase   و الـ  Topoisomerase  وإذ ان ارتباط الشريطين يكون عن طريق الأواصر الهيدروجينية فقد وجد بان الحرارة العالية ايضاً تؤدي الى فتح الشريطين وقد استثمرت هذه الظاهرة في تحقيق المرحلة الاولى من الـ PCR وذلك برفع درجة الحرارة لمحلول التفاعل والذي يحتوي على قالب الدنا من (92 – 95 مْ) ولوقت يتراوح بين (3 – 5) دقائق للحصول على شريط مفرد ليعمل كقالب لبناء القطعة المكملة لها وتعتمد عملية المسخ على عدد من العوامل كنوعية ومصدر دنا القالب ونوع الإنزيم المستخدم.

q مرحلة ارتباط البادئ Primer annealing    

وهي المرحلة التي تأتي بعد مرحلة المسخ مباشرة إذ يتم فيها ارتباط البادئات مع

 التتابعات من القواعد النتروجينية المكملة لها في الشريط المفرد من ألدنا القالب

 وذلك ببناء الأواصر الهيدروجينية بينهما وتعتمد درجة الحرارة وطول الفترة 

الزمنية اللازمة لهذه المرحلة على العديد من العوامل التي تحدد كفاءتها ، ومنها

 تركيز وطول البادئ ونسبة احتوائه على قواعد  G+C ويتم احتساب درجة 

الحرارة اللازمة للارتباط من خلال تطبيق احدى المعادلات الحسابية الملائمة 

لطول البادئ وذلك لاستخراج الدرجة الحرارية الحقيقية لتفكك 50% منه Melting

 Temperature  ( Tm )  والتي يمكن حسابها على وفق المعادلة الأتية :

(2* عدد قواعد A+T) +   (  عدد قواعد G+C*4) =  حرارة الألتحام

• الا ان هذه المعادلة تكون ملائمة للبادئات ذات التتابعات القصيرة دون 20

 نيوكليوتيدة اما البادئات التي يتراوح طولها من 20 – 30 نيوكليوتيدة فان المعادلة

 الأتية تكون مناسبة لها  :

  درجة الحرارة المثلى للالتحام = 22 + 1.46 [ 2 ( G  +  C   ) + ( T  +  A ) 

     

• وهناك معادلات أخرى لأنواع أخرى من البادئات إلا أن نتائج اغلب البحوث أشارت الى أن المعادلة الأولى هي الاشمل مع إضافة 3 – 12 درجة حرارية إلى الناتج لتعطي درجة الحرارة المثلى للارتباط .

qمرحلة الاستطالة   Stage  Extension :

 وهي المرحلة الاخيرة من تفاعل الـ PCR   وتتضمن عملية إضافة الـ dNTPs الى النهاية OH للبادئ عند منطقة ارتباطه بقالب الدنا لتكوين شريط دنا مكمل لذلك القالب من قبل إنزيم البلمرة ، و ان افضل درجة حرارية تتم فيها عملية الاستطالة وهي الدرجة الملائمة لاعطاء أعلى فعالية للإنزيم وهي 72 مْ أما المدة اللازمة لذلك فتختلف حسب نوع المؤشرات المستخدمة والمؤشرات التي تعطي نواتج تضاعف كبيرة الحجم تحتاج الى وقت اطول من تلك التي تعطي نواتج تضاعف قصيرة وذلك لقدرة انزيم البلمرة المستخدم Taq DNA polymerase على بناء 35 – 100 نيوكليوتيدة في الثانية وعلى العموم تكون الفترة اللازمة للاستطالة أطول (10 دقائق) في الدورة الأخيرة لتفاعلات الـ PCR  وذلك لضمان استطالة جميع نواتج التفاعل وتجدر الاشارة الى ان عدد الدورات المستخدمة في تفاعلات الـ PCR وهي 40 دورة كافية للحصول على عدد نسخ ملائمة  للدنا الهدف بحيث يمكن رؤيتها عند الكشف عنها باستخدام هلام الاكاروز كما ان فعالية الانزيم تقل بعد ذلك العدد من الدورات.

ديناميكية تفاعل الـ PCR

 

بعض الطرائق الشائعة في المؤشرات الجزيئية

تقانة تباين أطوال قطع الدنا المتضاعفة AFLP

qتعد مؤشرات الـAFLP من مؤشرات الدنا المعتمدة على التضاعف العشوائي لسلسلة الدنا ويستند هذا النوع من المؤشرات إلى مضاعفة قطع معينة من الدنا  المقيدة من خليط تفاعل الـPCR وإظهار التباين بوجود او غياب هذه القطع فضلاً عن التباين بأطوالها وتستثمر هذه الطريقة مزايا نوعين من مؤشرات الدنا وهي الـRFLP و الـRAPD في آن واحد إذ استمدت مؤشرات الـAFLP مرحلة هضم الدنا المجيني بالإنزيمات القاطعة من مؤشرات الـRFLP وكما هو معروف تقوم هذه الإنزيمات بإنتاج قطع من الدنا بأعداد كبيرة وهذا يزيد من احتمالية الحصول على تباينات بأطوال تلك القطع فضلاً عن ان الاعتماد على إنزيمات التقييد يمنح مؤشرات الـAFLP صفة امكانية الحصول على نفس النتائج عند التكرار Reproducibility ذلك ان صفة الثبوتية للمؤشرات الوراثية من العوامل المهمة في اختيارها لدراسة التحليل الوراثي للكائن الحي ومن جانب آخر استمدت مؤشرات الـAFLP السرعة والدقة والميزات الأخرى من طريقة الـRAPD.

      مراحل تطبيق تقانة الـAFLP

أولاً : مرحلة هضم الدنا   DNA digestion :

يتم تحليل مجين الكائنات الحية من خلال تقطيع دنا هذه الكائنات الى اطوال محددة وتتابعات مميزة يمكن استخدامها فيما بعد في اغلب تقنيات الهندسة الوراثية، ويتم ذلك باستخدام نوع خاص من الإنزيمات تدعى إنزيمات التقييد Restriction Endonuclease وتم عزل هذه الإنزيمات من أنواع عديدة من البكتريا التي تستخدمها كوسيلة دفاعية ضد العاثيات المنتهكة لها، إن ما تقوم به الإنزيمات القاطعة هو كسر الأواصر الفوسفاتية ثنائية الاسترالتي تربط النيوكليوتيدات المتجاورة على الشريط المفرد من الدنا الحلزوني وانتاج قطع ذات نهايات لزجة  لتسهل مهمة المرحلة اللاحقة وتقاس فعالية الإنزيم من خلال قدرته على هضم كلي لمايكرو غرام واحد من دنا العاثي لامبدا النقي خلال ساعة واحدة وبدرجة حرارة 37 مْ التي يعبر عنها بالوحدة الانزيمية (يستخدم في مؤشرات AFLP نوعين من إنزيمات التقييد احدهما يمتاز بالقطع عالي التكرار Frequent Cutter والآخر يكون قطعه قليل او نادر التكرار Rare Cutter.

• ان هدف مؤشرات الـAFLP يحتم اجراء هضم كلي Complete Digestion لعينات الدنا وذلك للحصول على اعلى درجات التقطيع ، ويفسر الباحثون استخدام نوعين من إنزيمات التقييد في آن واحد بأن القطع عالي التكرار للإنزيم الأول ينتج قطعا من الدنا صغيرة تكون مناسبة لعمليات التضاعف في الـ PCR وتصبح بعدئذ ضمن معدل الحجم المثالي للفصل على هلام الترحيل الكهربائي ، كما إن استخدام مثل هكذا إنزيم لوحده ينتج اعداد كبيرة جدا من القطع التي لا يمكن الافادة منها لظهورها على هلام الفصل بشكل مسحة طويلة ، ولزيادة احتمالية وجود تباينات بين هذا الكم من القطع يستخدم إنزيم قليل القطع مما سيؤول الى وجود ثلاث انواع من قطع الدنا في خليط التفاعل،  النوع الاول منها ناتج بفعل الانزيم عالي التكرار وتشكل 90% من مجموع قطع الدنا . اما النوع الثاني فهو ناتج فعل إنزيمي التقييد لذا تصبح لهذه القطع نهايتان مختلفتان Rare/Frequent Cutter Fragments  وتكون نسبتها في الخليط قليلة إلا أنها بنفس الوقت تشكل ضعف نسبة النوع الثالث من قطع ألدنا الناتجة من فعل إنزيم قليل التكرار لوحده.

 ان قطع الدنا مختلفة النهايتين ستكون محور البحث عن التباين في مؤشرات الـAFLP كونها ستقلل الحاجة الى زيادة عدد النيوكليوتيدات الاضافية للبادئات المستخدمة ، ويمنح استخدام إنزيمي قطع مختلفة زيادة في احتمالية إيجاد تباينات بين القطع وبالتالي فأن اعداداً كبيرة لمختلف البصمات يمكن الحصول عليها باستخدام اتحادات متباينة من عدد قليل من البادئات.

ثانياً : مرحلة لحم المكيفات   :Adapters ligation 

stage  

تعد هذه المرحلة من المراحل الأساسية لبناء مؤشرات الـAFLP اذ يتم فيها إضافة المكيفات (الوصيلات) Adapters الى طرفي القطع المهضومة وذلك لتهيئتها الى عمليات التضاعف اللاحقة ، ويقصد بالمكيفات هي التتابعات القصيرة من النيوكليوتيدات المزدوجة Double Strand وتتألف من حوالي ( 8 – 24 ) نيوكليوتيدة ذات نهايتين لزجة منزوعة الفوسفات ، وتتألف المكيفات من التتابعات المتوافقة مع موضع الإنزيم القاطع وفي بعض الحالات تضاف بعض القواعد (1 – 3 ) إلى تتابعاتها لتزيد من مرونة اختيار وتصميم بادئات التضاعف، وتعتمد عملية ربط قطع الدنا على فعالية انزيم الدنا اللاحم DNA Ligase الذي يتصف بقابليته على لحم الكسور في العمود الفقري لجزئية الدنا عن طريق اعادة بناء الاواصر الفوسفاتية ثنائية الاسترPhosphate diester bonds وذلك بين مجموعة الهيدروكسيل OH  في نهاية ^-3 لإحدى النيوكليوتيدات ومجموعة الفوسفات PO₄^- في النهاية ^-5 للنيوكليوتيدة المجاورة وذلك لربط سلسلة واحدة من الشريط أما السلسلة الثانية فتربط نتيجة لنشاط انزيم البلمرة Tap DNA polymerase الذي يقوم بملء الفراغ الحاصل بين قطع المكيفات وسلسلة الدنا المجاورة.

ثالثاً:مرحلة التضاعف التمهيدي    Preamplification  :

تتضمن هذه المرحلة وبشكل أساسي مضاعفة القطع التي تم تحديد نهايتها بإنزيمي التقييد وربطت معها المكيفات الخاصة بها ، من خلال تفاعل مضاعفة سلسلة الدنا PCR بوجود بادئات خاصة تحتوي على تتابعات مكملة لتتابعات موقع القطع للإنزيم فضلاً عن تتابعات مكملة لتتابعات المكيفات، وتكمن اهمية هذه المرحلة في استبعاد قطع الدنا من مزيج التفاعل والتي لا تتوفر فيها شروط القطع والالتحام لعدم وجود مواقع الارتباط بها وكذلك استبعاد القطع صغيرة الحجم  

والناتجة (على الأرجح) من إنزيم القطع عالي التكرار التي تشكل 90% من العدد الكلي الناتج من عملية التقطيع اعتمادا على الاسس الأتية :

 من خلال استخدام درجة حرارة التحام عالية High Annealing Temperature لان البادئات الملائمة لهذه القطع تتطلب درجات التحام واطئة وهي اقل من درجة التحام البادئات الملائمة لقطع الدنا ذات الاحجام الاكبر وبذلك تكون القطع الصغيرة اقل كفاءة من الالتحام مقارنة بالقطع الاخرى .

•ان القطع الناتجة من فعل انزيم عالي التكرار تكون صغيرة الحجم ولها نهايتان متعاكستان Inverted Ends مما يسبب تضاعفها مع بادئ واحد فقط ، فضلاً عن إن أشكال من الساق الملتوي Stem-loop Forms قد تتكون من ازدواج القواعد في نهايتي القطعة وبالتالي تزاحم وتمنع التحام البادئ معها ، وهذا ما يعزز ان القطع التي سوف تتضاعف هي القطع الاكبر حجما في حالة استخدام بادئ واحد مكمل لقطع الدنا الناتجة من فعل إنزيم عالي التكرار ، علما ان شكل الساق الملتوي يصعب تكوينها في القطع الأكبر حجما لذا لوحظ ان القطع التي يتراوح طولها بواحد كيلو زوج قاعدي (K-base pair) تكون مؤهلة اكثر للتضاعف من القطع الأخرى عند استخدام بادئ واحد.

مما تقدم تتضح أهمية تصميم البادئات الذي يعده البعض العامل الحاسم في عمليات التضاعف الناجحة ، وهذا سيؤدي إلى تحديد وتهيئة القطع المؤهلة إلى مرحلة التضاعف الانتقائي ، ومع هذا التحديد قد تكون أعداد قطع الدنا في هذه المرحلة كبيرة جدا وخاصة في مجين الكائنات الراقية لذا يعمد البعض إلى إضافة (1 – 3) نيوكليوتيدة الى تتابعات بادئات هذه المرحلة ليضمن تقليل اعداد تلك القطع وذلك من خلال تـقليل

احتمالية توافق التتابعات النيوكليوتيدية للبادئ وتتابعات القطع المؤهلة من دنا الهدف ، اذ ان من المعروف ان اضافة كل نيوكليوتيدة واحدة يقلل عدد القطع الناتجة من التضاعف بمقدار اربعة مرات. ومن الجدير بالذكر ان نجاح هذه المرحلة  يعتمد على توفير الظروف المثلى لتفاعل الـ PCR إذ ان تركيز البادئات وإنزيم البلمرة وكذلك دنا القالب لهما الاثر المباشر في ذلك  لذا يصار الى عمل عدة تفاعلات وبتراكيز مختلفة لهذه المواد بغية الحصول على التركيز الامثل لها.

رابعاً : مرحلة التضاعف الانتقائي      Selective Amplification :

وهي المرحلة الاخيرة من مراحل اعداد مؤشرات الـAFLP للكشف اذ يتم فيها الحصول على نواتج تضاعف (حزم) منتخبة واضحة المعالم ويمكن فصلها من خلال الترحيل الكهربائي ثم احتسابها accounting لتحليل النتائج . ان ما يجب الاشارة اليه هو العدد الكبير لقطع الدنا في خليط التفاعل في هذه المرحلة على الرغم من محاولات تشذيبها في المراحل السابقة ، لذا يعمد أولا إلى تخفيف نواتج المرحلة السابقة من (5 – 10) مرات وحسب نوعية المجين المستخدم كقالب لتقليل عدد نسخ كل قطعة ، ومن ثم القيام بعملية انتخاب ومضاعفة قطع الدنا مختلفتي الطرفين rare/frequent fragment ends اعتمادا على نفس الاسس التي اعتمدت في مرحلة التضاعف التمهيدي فضلاً عن ما ياتي:

تتالف بادئات هذه المرحلة من مؤشرات الـAFLP باحتوائها على ثلاثة اجزاء، الجزء الأول منها هي النهاية ^-5 المؤلفة من تتابعات نيوكليوتيدية مكملة لتتابعات المكيفات التي أضيفت في وقت سابق والجزء الثاني يتالف من تتابعات مكملة لتتابعات مواقع القطع الإنزيمي ، اما الجزء الاخير فيتألف من تتابعات مكملة للتتابعات النيوكليوتيدية للبادئ الذي أضيف في المرحلة السابقة من التضاعف     (التمهيدي) وهذا الجزء يشكل النهاية ^-3 للبادئ الجديد ، لذا يعمد في هذه المرحلة الى اضافة بادئات ملائمة الى موقع قطع كل إنزيم والمكيف الخاص به فضلاً عن تسلسل قواعد بادئات المرحلة السابقة مع اضافة قواعد اخرى عند الطرفين من (1 – 4) قواعد، ويضاف زوج من البادئات في كل تفاعل PCR لننتقي من بين هذا الكم من القطع ما هو ملائم لها مما يؤدي الى تقليل عدد القطع المتضاعفة وهذا ما أكدته الدراسات التي قامت بتعليم المكيفات او البادئات المضافة . وتتم المقارنة بين اطوالها والتي تعتمد على كل الظروف السابقة, أما الأساس الأخر المهم الذي يعتمد عليه انتخاب قطع ألدنا المرغوبة فهو البرنامج الذي يصمم لجهاز المبلمر الحراري Thermocycler اذ تلعب درجات الحرارة المختلفة بالتحديد في مرحلة التحام البادئات الدور المهم في تمييز وانتخـاب القطـع المرغوبةويتحقق ذلك من خلال برمجة الجهاز بدورة أولية First cycle تكون درجة الالتحام فيها عالية تصل الى 65مْ اذ من المعروف ان مثل هذه الدرجات الحرارية تكون ملائمة لارتباط البادئات بقطع الدنا الكبيرة ، مما يؤدي إلى إقصاء ما تبقى من قطع ألدنا الصغيرة ، أما الدورات اللاحقة من البرنامج فتصمم على أساس انتخاب قطع ألدنا الملائمة والمتحملة للتدريج الحراري التنازلي من خلال 2 – 13 دورة تنحدر فيها درجة حرارة الالتحام في كل دروة لتصل عند درجة 56مْ . ان الانخفاض بدرجات الحرارة سيؤدي إلى استبعاد القطع الكبيرة جدا والتي تمثل معظمها قطع ألدنا الناتجة من إنزيم القطع قليل التكرار في خليط التفاعل وبشكل تدريجي وصولا إلى انتخاب القطع الاكثر تنافساً مع البادئين المستخدمين وهي عادة تكون القطع ذات الطرفين الناتجين من فعل الإنزيمين القاطعين ، أما المرحلة الأخيرة من التضاعف فتتم من خلال (14 – 36) دورة تكـون فيها درجة الالتحام واحدة  هي  56مْ

•ان اختيار توليفة البادئات Primer Combinations يكون متخصصاً من ناحية ان تتابعاتها تكون مطابقة مع الإنزيمات والمكيفات والبادئات السابقة ويكون عاماً Universal في حالة وجود قواعد إضافية من ناحية اخرى .

•كما ان دقة اضافة توليفة البادئات وتركيزها من العوامل المهمة التي تحدد عدد ونوعية القطع المتضاعفة الناتجة . إذ أظهرت الدراسات السابقة ان استبدال أي قاعدة إضافية من البادئات يظهر في طرز الحزم المتميزة Unique and  Polymorphic Bands   .

     ميزات الـ AFLP

qاشارة الى ما تقدم فان مؤشرات الـ AFLP تمتاز بالدقة والقدرة على اظهار الطرز patterns المميزة لكل فرد، فاصبحت الطريقة السائدة والمثلى لبناء البصمات الوراثية DNA Fingerprinting لما تمتلكه هذه الطريقة من ثبوتية لمؤشراتها إذ يمكن الحصول على نفس الطرز من الحزم عند تكرار نفس التجربة فضلاً عن أنها لا تتطلب معرفة مسبقة بتتابعات ألدنا المدروسة ، وتمتاز هذه المؤشرات عن غيرها من مؤشرات الدنا بإمكانية الاحتفاظ بمحاليل خزينة من كل مرحلة عمل دون الرجوع الى تحضيرها مرة اخرى وهذا ما يزيد في امكانية المناورة بتلك المحاليل ولفترات طويلة.  

     عيوب AFLP

على الرغم مما امتازت به مؤشرات الـAFLP من مميزات جعلتها الرائدة في الدراسات التحليلية لدنا مختلف الكائنات الحية فأن الباحثين وجدوا لها بعض المحددات أهمها هي عدد المراحل التي تتطلبها لبناء المؤشر من ناحية وكونها تشترط ان عينات الدنا تؤخذ من نسيج واحد لكل النماذج المدروسة من ناحية اخرى ، وبذلك بقيت الدراسات قائمة لإيجاد أنواع أخرى من المؤشرات.

     هضم الدنا المضخم بأنزيمات القطع RFLP

     أحد المعلمات الجزيئية التي تتضمن تضخيم سلسلة محددة ومصانة من سلسلة الدنا (وهي عبارة عن تتابع أسس دنا مشترك وثابت من حيث نوع الأسس وتسلسلها بين أنواع وسلالات مختلفة) باستخدام الـPCR  ثم يتبع ذلك هضم بأنزيمات القطع المحددة والتي بإمكانها أن تظهر الاختلافات الوراثية بين الأفراد إذ يتم استثمار الاختلافات (التباينات) في سلسلة الدنا لإجراء القطع ومن ثم رؤية نمط العصابات الناتجة باستخدام الرحلان الكهربائي بحيث يكون نمط القطع مميز للنوع الواحد.

qميزات الطريقة:

•تعتبر ذات سيدة مشتركة في التوريث.

•إظهار التباين على مستوى تسلسل الدنا وليس البروتين.

qمساوئ الطريقة:

تتطلب كميات كبيرة نسبياً من الدنا.

  التعددية الشكلية لقِطَع الـ DNA المُكاثرة عشوائياً  RAPD

•هي واحدة من مؤشرات الدنا المستثمرة لفعالية التفاعل التضاعفي لسلسلة الدنا PCR وتعرف على أنها تضاعف ألدنا المجيني إنزيميا باستخدام مرئسات عشوائية. تأخذ هذه الطريقة التحليلية أهميتها من استخدام عدد كبير من المرئسات القصيرة الوحيدة غير مزدوجة مؤلف من عشرة أسس آزوتية على الاكثر (ذات تتابعات عشوائية لكن غالباً ما تحتوي على GC بنسبة 50 % على الأقل) لإنتاج طيف من منتجات التضخيم لمواقع معينة منتشرة على المجين. من الطرائق الهامة والفعالة عند وجود مادة مرجعية للمقارنة مع المادة المراد فحصها ولكن عند وجود معلومات قليلة أو عدم توافرمعلومات حول سلسلة الدنا الهدف؛ فإن هذه الطريقة ليست بذات الأهمية إضافة إلى أن تكرارية هذه الطريقة ضعيفة. يعتمد هذا النوع من مؤشرات الدنا على عدد مواقع ارتباط  البادئ Binding مع الدنا المجيني من جانب، وتعتمد كذلك على البعد بين تلك المواقع Primer Distances  من جانب اخر.

ان التباين في أعداد المواقع وأبعادها بين الأفراد ينتج اما طبيعياً من خلال الاتحادات الجديدةRecombination  اثناء الانقسام الأختزاليMeiosis ، واما عن طريق الطفرات Mutations  وكلاهما يسبب حالات الحذف Deletion،او الاضافة Insertion،او الاستبدال Substitution، وخصوصاً تلك التي تحدث في مواقع الارتباط المشار اليها مما يؤدي الى تغير في ترتيب القواعد المكملة لنتائج البادئ مما يفقده فرصة الارتباط به لاسيما انه يتأثر بتغيرات قاعدة واحدة فقط ، وتشير المصادر الا انه تمت الافادة من الطاقة الكامنة لمؤشرات الـ RAPD   في مجالات متعددة منها الكشف عن التباينات الوراثية بين الأفراد، وتحديد العلاقة الوراثية والتمييز والتشخيص بين الأنواع والأصناف الزراعية فضلاً عن تمييز المبكر للجنس ودراسة الثبات الوراثي للنباتات الناتجة من زراعة الأنسجة النباتي.

مميزاتها :

1- تطبق على مختلف الأنواع (إنسان ، حيوان ، نبات ، بكتيريا....الخ) .

2- هي تقنية سريعة وبسيطة لا تحتاج لخبرة.

3- تكاليفها زهيدة .

مساوئها:

1- تقنية عشوائية .

2- تكشف عن وجود السيادة أو عدم وجودها فقط أي أنها تميز بين النمطين الوراثيين (AA & aa) وتعجز عن التميز بين النمطين(AA & Aa).

3  - نتائجها غير قابلة للتكرار...أي لا يمكن مقارنة نتائج اختبار الـ (RAPD) لعينة ما وبنفس الشروط في مختبرين اثنين وطبعاً هذا ناتج عن كون هذه التقنية عشوائية .

      

    مؤشرات التتابعات البسيطة المكررة : SSR  

وهي احدى مؤشرات الدنا الحديثة والمتمثلة بإمكانية الكشف عن التباينات لمناطق من الدنا لها تتابعات متكررة ترادفياً Sequence Repeats  Simple يتراوح طولها من (1 – 5) زوج قاعدي وتنتشر على معظم مناطق مجين الكائنات وتحدد مثل هذه المناطق من المكررات حافات او جوانب Flanks ذات تتابعات فريدة Unique Sequence لكل منطقة مكررات ، وكذلك تكون مميزة للنوع لذا تصمم بادئات تفاعلات الـPCR بهذا النوع من المؤشرات لتكون متوافقة مع هذه الجوانب. ومن مميزات هذه الطريقة بالمقارنة مع المؤشرات الـAFLP هو انها ترتكز على اظهار التباينات الوراثية في المناطق الجانبية لمواقع المكررات الترادفية الموجودة بصورة طبيعية في مجين الكائن بينما في مؤشرات الـAFLP يقوم الباحث ببناء تلك الجوانب.

• أصبحت معلمات التوابع البسيطة الترادفية SSR الأداة المستخدمة في تعريف العديد من الأنواع في الوقت الراهن لأنها تعتمد على تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) وذات تكرارية عالية، متعادلة السيادة وذات تعددية مورفولوجية في مجين النبات . إضافة إلى أنها في العديد من الحالات تعد ثابتة بين الأنواع وهذا ما يجعلها ذات قابلية للإنتقال بين الأنواع المتقاربة وبالمقارنة مع التقنيات المعتمدة على DNA فإن تقنية SSR هي التقنية الأكثر فاعلية وفائدة في دراسة التنوع الوراثي بالإضافة إلى ذلك، تتميز هذه المؤشرات بارتفاع مستوى التعددية التي تكشفها مقارنة بعدد من التقانات الأخرى وكذلك بسهولة تطبيقها وتحليل نتائجها وكذلك في التمييز بين الأنواع وتوضيح العلاقات التطورية وتصنيف المجموعات الوراثية عرف ( Kahl ، 2001 ) الميكروساتلايت بأنها أي تسلسل لقواعد أزوتية قصيرة جداً ذات أطوال بين     2 و 10 bp  زوج قاعدي تكراريتها متوسطة، توجد بشكل كبير وبتسلسلات ذات طبيعة متغايرة في كل المجينات بالفطور والنبات والحيوان والإنسان.

•تتميز تقنية SSR  عن بقية المعلمات الجزيئية بأنها تسمح بتعريف العديد من الأليلات في الموقع المفرد الواحد، كما تتوزع على كامل المجين، بالإضافة لأنها تظهر السيادة المشتركة.

   التوابع الترادفية البسيطة الداخلية (ISSR):

تعد هذه التقنية واحدة من التقانات الهامة المعتمدة على التفاعل التسلسلي البوليميرازي (PCR) وأحد المؤشرات الجزيئية المثالية للأسباب التالية:

1- تضخم منطقة التوابع الترادفية البسيطة ويستخدم بادئ وحيد ومؤلف من قطع متكررة ومحاط في بعض الأحيان بـ 2-4 نيكليوتيدات أما في المنطقة '3 أو5' .

2- وتوصف تقنية ISSR بأنها أكثر تكرارية من تقنية RAPD بسبب طول البادئ المستخدم والذي يعكس درجة حرارة عالية لمرحلة تشفع البادئات.

3- إمكانية الكشف عن التتاليات النيكليوتيدية ذات السيادة في التوريث.

4- وفرتها وتواجدها في مجينات حقيقيات النوى النباتية ولا تحتاج إلى معلومات عن التسلسل المجيني المدروس.

5- أضف إلى أن نتائجها ثابتة عند تكرارها وسريعة  كما أنها تتطلب كمية قليلة من الحمض النووي DNA ،  ويمكن أتمتتها automation  وحيث أنه يمكن نشر البادئات وتبادلها بسهولة بين المخابر بمجرد معرفة التسلسل النيكليوتيدي لها. وتكشف نسب عالية من التعددية الشكلية polymorphism وبنفس المقدرة التقنية.

CAPS ( Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) 

    عندما يكون تسلسل الـ DNA في منطقة طفرة معينة غير معروف، يتم الكشف عن التغيرات في النيوكليوتيدات عن طريق أنظمة عشوائية مثل الـ “RFLPs” المعتمِد على تقطيع الدنا الجينومي. لكن احتمال أن يعدِل تغير نيوكليوتيد واحد من موقع لقطع أنزيمي  يعتبر قليل . لذلك فقد زاد الطلب في السنوات الأخيرة على تقنية بسيطة وسريعة  للكشف عن الـ  SNPs بسبب الاستخدام المتزايد للأخيرة في الأبحاث الصناعية والعامة.

:CAPSكشف التباين الوراثي النقطي باستخدام مرئسات متخصصة لتضخيم موقع ما من الدنا ثم تقطيع ناتج التضخيم بأنزيمات القص ثم  الكشف عن نواتج التقطيع على هلامة أغاروز.

تقنيات البيولوجيا الجزيئية

1- الإستنساخ.

2- تفاعل الوليمراز التسلسلي.

3- الرحلان الكهربائي.

4- معرفة التسلسل النووي.

5- التهجين الجزيئي.

استنساخ الدنا  (قص ولصق الدنا)  DNA cloning: cut and paste DNA

1- تحدد القطعة المراد نسخها ويضاف إليها إنزيم قاطع محدد يقوم بقطع الـDNA في مكان محدد حسب التسلسل النووي.

2-  يضاف نفس الإنزيم للناقل و الذي يقوم بقطعه أيضا في نفس التسلسل النووي.

3- تضاف القطع المراد نسخها بعد قطعها بالإنزيم القاطع إلى الناقل المقطّع فتتداخل التسلسلات النووية بين الناقل و بين قطع الـDNA المراد نسخها. فينتج قطعة مهجنة من الناقل و بداخله القطعة المراد نسخها (مورثة).

و ترتبط قطعة الـDNA مع البلازميد لذلك يضاف إنزيم اللاصق (Ligase ) إن أكثر لناقلات استخداما هي البلازميد و لكن يمكن استخدام الفيج أو الياك أو أي ناقل أخر.و الذي يحدد نوع الناقل المراد استخدامه هو في العادة كبر القطعة المراد استنساخها.

ففي حالة القطع الصغيرة يستخدم البلازميد أو الفيج  بينما يستخدم الياك أو الباك في حالة القطع الكبيرة .

نقل القطعة المهجنة و التي هي بداخل الناقل إلى خلية حية:

•في الغالب تستعمل البكتيريا (E.Coli) و ذلك لسهولة إدخال الناقل إليها، و إلى سرعة انقسامها (تنقسم البكتريا تقريبا كل 20 دقيقة)، إضافة إلى توفر طرق الاختيار خاصة التي تعتمد على خاصة الحماية من المضادات الحيوية. 

• و يدخل البلازميد أو الفاج تلقائيا إلى داخل البكتيريا بينما الناقلات الأخرى تحتاج إلى مساعدة ،و في العادة بتغيير تركيز الأملاح المحيطة بالبكتيريا أو تعرض إلى نبضة كهربائية لكي يسمح الجدار المحيط بالبكتيريا بدخول الناقلات.

•و من طبيعة البكتريا إنها تنقسم تلقائيا و بشكل سريع و كذلك البلازميدات.

  فصل قطع الدنا على الجل بالكهرباء (Gel Electrophoresis):

يمتلك الحمض النووي شحنة سالبة ولذلك فعند وضع الدنا في طرف من أطراف لوح الجيل ثم تعريضها لتيار كهربائي بحيث يكون القطب السالب عند الطرف الذي وضع فيه الدنا والقطب الموجب عن الطرف الأخير من ألواح فان الدنا ينتقل تلقائيا باتجاه القطب الموجب.

 تتوقف حركة قطع الدنا على عدة عوامل:

الوزن الجزيئي لقطع الدنا، فالقطع الصغيرة تتحرك بشكل اكبر من القطع الكبيرة، و يمكن تحديد الحجم الفعلي لكل قطعة عن طريق إضافة ماركر (قطع معروفة الحجم من الدنا) والتي تكون مقياس يرجع إليه لاستنتاج أحجام القطع.

شدة التيار الكهربائي.

تركيز الهلامة.

•هناك نوعان أساسيان من ألواح الجيل، الأغاروز جل  (Agarose gel) والبولي اكريليميد (Polyacrylamide gel ).

•و نظرا لصغر الفراغات التي بين البولي اكريليميد فانه يستخدم لفصل القطع الصغيرة الحجم من الدنا (اصغر من bp 500 (بينما يستخدم الأغاروز للأحجام الأكبر من الدنا. و التي يتراوح حجمها بين 300 إلى 10000 جزيء من الدنا.

•مادة الأغاروز هي مادة سكرية مستخرجة من الطحالب و عند تحضيرها فإنها تشبه في قوامها الجيلاتين.

•لا تكون القطع المفصولة بالبولي اكريليميد و الأغاروز واضحة للعيان و لذلك فان لوح الجيل يعرض إلى مادة لصباغة الدنا و اشهر هذه المواد هو مادة برميدات الاثيديوم  (Ethidium Bromide ) والتي تضيئ عند تعريضها للأشعة فوق البنفسجية.

  معرفة التسلسل النووي DNA sequencing:

هناك طريقتان أساسيتان لمعرفة التسلسل النووي لأي قطعة من الدنا:

الأولى تسمى بالطريقة الإنزيمية Enzymatic method  والأخرى بالطريقة الكيميائية(Chemical )  و لقد طغت الطريقة الأولى حتى أصبحت هي الطريقة الأكثر استعمالا.

الطريقة الإنزيمية (Enzymatic method):

 يطلق على هذه الطريقة أيضا طريقة سنجر (Sanger procedure) نسبة إلى د.فريدريك سنجر و الذي أسس هذه الطريقة. كما أنها أيضا تعرف التسلسل عن طريق دي ديوكسي dideoxy sequencing و تترتكز هذه الطريقة على مفهوم أن شريط الدي إن أي في الأساس مبنى من جزيئات من الديوكس نيوكلويتيد ويوجد على النقطة الثالثة من حلقة السكر الريبوزي مجموعة مؤكسدة (مجموعة هيدروكسيل) (OH) وهذه النقطة هي التي ترتبط في النقطة الخامسة من الجزيء الذي يليها  وهكذا يتم الترابط لتكوّن شريط طويل من الدي إن أي. و لقد قام د.ستنجر بالاستفادة من هذه الخاصية فبدّل الجزيء من ( (OHإلى(H) عن طريق إضافة دي ديوكسيو نكليوتيد(ddNTPs ) بدل من ديوكسي نيوكلوتيد(  dNTPs) و ذلك عن طريق نسخ الشريط مرة أخرى و هذا يؤدي الى توقف ترابط الجزيئات و يكون في طرف كل جزيء نوع واحد من الأحماض النووية. 

خطوات التعرف على تسلسل الدنا:

1- نسخ الدنا و ذلك على الشكل التالي:

•أ- أضافة البرايمرالمعرّف (ملتصق بطرفة) عنصر مشعspecific primer) ) إلى عينة الدنا.

•ب- تقسيم العينة إلى أربع أنابيب و كل أنبوب  بإسم أحد النكليوتدات الأربعة (dGTP، dATP، dCTP، and dttp).

•ج- أضافة إنزيم البولمريز DNA polymerase)).

•د-أضافة إلى كل أنبوب نوع واحد من الدي ديوكسي نيوكليتيد حسب اسم الأنبوب و بالإضافة إلى كمية من ديوكسي نيولكليتيد، يحدث التفاعل و يبدا البرايمر ببنانءو تركيب هذه الأحماض النووية. وعند إضافته لدي ديوكسي نيوكليتيد فان الشريط يتوقف على هذه النقطة، ثم يحدث تفاعل أخر لنسخ شريط أخر و عند إضافة دي ديوكسي نيوكليتيد يتوقف التفاعل و هكذا تستمر العملية و ينتج في النهاية قطع منسوخة و متفاوتة الطول في كل أنبوب اختبار.

2- اجراء رحلان كهربائي للمنتجات التضخيم:

بحقن كمية من منتجات التضخيم من كل الأنابيب في حقل خاص على هلامة الاغاروز ثم امرر تيار كهربائي و من ثم تظهر على طول اللوح القطع المنسوخة و المتفاوتة الأطوال في كل حقل.

3- تعريضها للأشعة (Autoradiography ) لكي يتسنى رؤية الدنا و الذي عليه مادة مشعة.

4- قراءة لوح الأغاروز من أسفل إلى الأعلى.

و لتسهيل عملية القراءة يستخدم الكمبيوتر لكي يقرأها بشكل ألي و ذلك بتعريض لوح الأغاروز إلى أشعة ليزر و عن طريق وحدة استشعار و مضخم للنبضات (photomultiplier ) يستطيع الكمبيوتر أن يحدد نوع الدي ديوكسي نيوكليتيد و ثم يرتبها و يطبعها و يعطيك رسماً بيانياً لاماكن كل حمض نووي و بالألوان، و لا تستخدم المواد المشعة في القراءة الآلية بالكمبيوتر بل يستعاض عنها بمادة مضيئة(fluorescen) ) توضع على البرايمر على أن يكون لكل دي ديوكسي نيوكليتيد لون مختلف عن الآخر(أي أربعة ألوان من المادة المضيئة).